1、細胞複蘇

將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖擺促進其融化。將融化的細胞移入離心管中，參加37℃預熱的DMEM完全培育基中（其中胎牛血清約為10%），悄悄吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

參加DMEM徹底培育基清洗，棄上清液。參加DMEM徹底培育基，悄悄吹打混勻，製成細胞懸液，接種於培育皿/瓶中，在含5% CO2的細胞培育箱中培育。

2、細胞傳代

當細胞密度達到80%~90%（過早產值缺乏，過晚細胞狀態欠安，1:2至1:10以上的比率傳代培育，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到別離再培育的一段時刻，非細胞有絲分裂次數）時，去掉徹底培育基，用1X PBS清洗2次。

參加胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞很好，很好的消化溫度是37℃。顯微鏡下調查細胞：倒置顯微鏡下調查消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此刻細胞消化適度）進行消化，放入細胞培育箱中約2-3min。

參加適量DMEM徹底培育基停止胰蛋白酶消化，轉移至離心管後500g離心2min，棄上清液，再參加DMEM徹底培育基清洗，棄上清液。

參加DMEM徹底培育基，悄悄吹打混勻，吸取10微升進行計數，然後依照所需細胞量在含5% CO2的細胞培育箱持續培育。

3、細胞凍存

當細胞密度達到80%~90%時，去掉徹底培育基，用1X PBS清洗2次。參加胰蛋白酶進行消化，放入細胞培育箱中約2-3min。參加DMEM徹底培育基停止胰蛋白酶消化，轉移至離心管後500g離心2min，棄上清液，再參加DMEM徹底培育基清洗，棄上清液。參加lml凍存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般來講血清含量能夠在10%-90%之間調整，凍存液中參加血清一方麵可認為細胞供給養分，另一方麵能夠在細胞凍存過程中供給非滲透性維護物質，如蔗糖，白蛋白等從而很好地維護細胞），放入凍存管內（管內有異丙醇，以確保溫度下降的速度），當即放入4℃冰箱中凍存30min，然後放入-20℃冰箱中凍存30min，再置於-80℃冰箱內過夜。然後放入液氮中，能夠保存至少兩年，如不放人液氮，能夠保存三個月。 

細胞凍存和複蘇的原則是：慢凍速融，這樣也會有利於堅持細胞的生機。凍存細胞不加任何維護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞逝世。

4、注意事項

（1）預熱培育用液：把已經製造好的裝有培育液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱；

（2）用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超淨工作台和雙手；

（3）正確擺放運用的器械：確保足夠的操作空間，不僅便於操作並且減少汙染；

（4）點燃酒精燈：注意火焰不能太小；

（5）嚴厲的無菌操作；

（6）貼壁細胞消化適度：消化的時刻受消化液的品種、製造時刻、參加培育瓶中的量等諸多要素的影響，消化過程中應該注意培育細胞形狀的變化，一旦胞質回縮，連接變鬆懈，或有成片浮起的痕跡就要當即停止消化；

（7）傳代細胞一切的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次還是要隻進行一種細胞的操作，每種細胞運用一套器件。避免交叉感染；

（8）傳代細胞瓶口每次翻開或許封閉都需要在酒精燈上消毒。